科研材料制备

高质量的研究材料是治疗性单克隆抗体研发的基础。科研材料制备技术平台利用多种成熟的分子生物学方法来制备优质的研究材料,包括主要用于动物免疫和抗体药物筛选的可溶性蛋白表达,膜蛋白的胞外部分的表达,及构建高效表达膜蛋白细胞系等。

蛋白质表达平台

        ---从基因克隆到蛋白质表达

利用HEK293和CHO-S细胞,我们建立了标准化的哺乳动物细胞表达系统,用于可溶性蛋白或细胞外结构域(ECDs)的表达,并将His标签、GST标签、人源Fc、鼠源Fc等不同的标签蛋白整合到哺乳动物细胞表达载体中。利用这些不同的标签蛋白,我们建立了相应的Western Blot 和ELISA检测方法可以定性和定量检测目的蛋白。根据客户的不同需求,我们既能利用大规模瞬时转染在短时间内获得目的蛋白,也能通过自主构建的表达载体获得可持续稳定表达目的蛋白的细胞库,使蛋白表达更经济有效。利用药明康德丰富的技术资源和优势,我们的蛋白生产能力扩展到哺乳动物细胞表达系统以外的其他系统如原核表达系统、昆虫表达系统乃至化学合成多肽。

表达系统

  • 哺乳动物细胞表达系统
  • 昆虫细胞表达系统
  • 原核表达系统

  • 哺乳动物细胞表达系统
    • 宿主细胞
      HK293, CHO-S
    • 表达载体
      pcDNA3.3, pCI, pLEX, pLENT, pFastBac
    • 标签蛋白
      GST, His, human Fc, mouse Fc, V5
    • 转染途径
      脂质体转染法、电转染法、病毒转染法
    • 表达容量
      Shaking flask 0.5-3 L
      Wave bag 5-50 L
      Bioreactor 1-50 L

在蛋白质纯化方面,我们具备从mini层析柱到中型层析柱多种不同规格的层析柱。我们既可以利用蛋白A mini亲和层析柱手工纯化多种少量的抗体,又可以利用搭配大型层析柱的自动层析系统AKTA 或Dual-flow进行较大量的蛋白质纯化。蛋白纯化实验室配备即用型亲和层析柱,包括偶联蛋白 A、蛋白G、GST的亲和层析柱以及 Ni离子层析柱;同时也能提供利用离子交换层析和分子排阻层析及疏水层析来纯化蛋白。蛋白纯化实验室配备专业的4℃低温实验室来纯化热不稳定蛋白。下游分析实验室可以利用多种不同的定性定量方法进行蛋白质特征和品质分析与鉴定,包括还原和非还原的SDS-PAGE、非变性 PAGE、western blot、UV280 或分析型HPLC定量分析、内毒素检测、质谱精确测定分子量、肽图谱、N端测序等。

  • 蛋白质纯化系统
    • 层析方法
      • 亲和层析
      • 离子交换
      • 疏水层析
      • 分子排阻层析
    • 纯化工艺及容量
      • 标准化4°C
      • 蛋白纯化可达克级
  • 蛋白质特征分析
    • SDS-PAGE, native PAGE
    • Western blot
    • UV280 或 分析型HPLC定量分析
    • 内毒素检测
    • 质谱精确测定分子量
    • 肽图谱
    • N端测序

细胞系构建

        ----从基因克隆到表达跨膜蛋白的细胞系

我们可选择不同动物来源的亲本细胞系包括HEK293、Ba/F3、C6、CHO-S、CHO-K1等,来构建各种表达跨膜蛋白的细胞系;丰富的表达载体库中,除携带不同选择标记的载体表达系统外,实验室还构建了病毒表达系统,如慢病毒;所有的表达载体都可以选择不同的表达标签以便于鉴定外源蛋白是否表达或选择无标签。利用丰富的亲本细胞系、表达载体、选择标记、启动子、标签蛋白,我们能提供多种设计方案以满足客户需求,并且实验室具有标准化的FACS和Mirrorball系统可用于细胞系鉴定。

  • 亲本细胞系
    • HEK293, Ba/F3, C6 和 CHO
  • 载体系统
    • pcDNA3.3, pDisplay, pLEX, pLENT
    • 标签蛋白: V5, c-myc, Flag tag or no-tag
  • 转染途径
    • 脂质体转染法、电转染法、病毒转染法
    • 瞬时转染构建高表达外源蛋白细胞库
    • 构建稳定细胞系持续高表达外源蛋白
  • 筛选鉴定
    • FACS
    • Mirrorball